1988年，李幼斌在自己的第一部电视剧《她曾经是我的妻子》中扮演主角。1994年，在电视剧《潮起潮落》中饰演主角鲁明宽。1999年参演电影《横空出世》，在其中饰演陆光达。[55]

2000年，在《非常代价》中饰演马超。参演电影《横空出世》。2004年在电影《惊涛骇浪》中饰演张子明，获得第9届华表百花最佳男演员奖提名。[10]2005年在电视剧《亮剑》中饰演李云龙，与童蕾、何政军、张光北等人合作。[11]获得第23届中国电视金鹰奖观众喜爱的男演员奖 。

2006年，主演《闯关东》，与萨日娜、刘向京、朱亚文等人合作。[12]2007年，在电视剧《仁者无敌》中饰演皮德贵。[13]2009年，根据红色经典巨著《红日》改编的同名电视剧开播，李幼斌在剧中出演国民党高级将领张灵甫。[14]2009年9月24日，领衔主演的电影《惊天动地》上映。

2010年，在谍战剧《旗袍》中饰演钱鹏飞，与马苏、王志文合作。[15]同年在夏雨主演的电视剧《师傅》中饰演老铁。[16]2011年，在《国门英雄》中饰演关汉生，与史兰芽、张志坚、田子田合作。[17]2012年，参演《老严有女不愁嫁》，饰演的是爱女如命，对未来女婿挑剔万分的倔强岳父。[4]2013年，主演电影《雷锋的微笑》，与万思维、唐国强等人合作。[18]同年在《爱的保镖》中饰演孙海山。[19]10月，主演悬疑剧《别让我看见》，饰演老刑警刘玉生。[20]2014年5月，在家庭轻喜剧《孙老倔的幸福》中，饰演孙老倔。[21]9月，主演谍战剧《邮差》。[22]2015年3月，在《决战江桥》饰演抗战英雄马占山将军。[23][24]2017年11月，主演主旋律电影《中国企业家》。[25]

2019年6月26日，李幼斌、史兰芽夫妻首次共同出演话剧《老式喜剧》在北京人艺实验剧场首演；[26]同年9月，特别出演的战争电影《九条命》发布了首支先导预告片[27]；10月16日，与张明健、李君峰、吴其江等合作主演的抗战剧《一马三司令》首播[28]。

演员李幼斌演过的电视剧很多。有《亮剑》、《闯关东》、《孙老倔的幸福》、《老严有女不愁嫁》、《爱的幸福》、《决战江桥》、《脊梁》等。角色塑造可圈可点，是我国著名影视剧演员。其中主演《亮剑》中的李云龙让李幼斌名声大振。获电视金鹰奖观众最喜爱的男演员奖。《闯关东》中朱开山这一形象也很不错。